牛α1酸性糖蛋白(α1-AGP)ELISA試劑盒

本試劑僅供研究使用      

實驗目的：

本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中白介素6(IL-6)的含量。

實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人白介素6(IL-6)水平。用純化的白介素6(IL-6)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入白介素6(IL-6)，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白介素6(IL-6)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中白介素6(IL-6)含量。

試劑盒組成：

應用

用于阻斷能受體對人內皮細胞體外血管生成的影響研究

普萘洛爾、酚妥拉明抑制人微血管內皮細胞體外血管生成目的研究離體情況下,p-AR阻斷劑普萘洛爾、a-AR阻斷劑酚妥拉明對人微血管內皮細胞增殖、遷移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表達的影響。

方法1.細胞免疫熒光鑒定內皮細胞：細胞采用免疫熒光染色Ⅷ因子進行鑒定。將人皮膚微血管內皮細胞和人腦微血管內皮細胞接種于24孔板爬片。待細胞融合至80%-90%時,4%冰固定20分鐘,0.2%Triton X-100通透10分鐘,羊血清封閉30分鐘。兔多克隆Ⅷ因子（vWF）一抗4℃濕盒內過夜。TRITC標記的羊抗兔二抗室溫孵育2小時（避光）。Hochest（1μg/ml）染核15分鐘（避光）后10%甘油封片。正置熒光顯微鏡下觀察、拍片（×200倍）。

2. Western blot檢測人微血管內皮細胞a-AR的表達：未經藥物處理的人皮膚微血管內皮細胞和人腦微血管內皮細胞經裂解獲得總蛋白。BCA定量,沸水滅活。取總蛋白約40μg進行SDS-PAGE凝膠電泳后,轉移到PVDF膜上。5%BSA封閉1小時,蛋白樣品分別在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗過夜。次日在37℃孵箱中孵育相應的二抗1h。采用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒顯色,于暗室內壓片,顯影定影。

3.細胞增殖實驗：將人皮膚微血管內皮細胞種植于96孔板,將不同濃度梯度的普萘洛爾（0,25,50,75,100μM）、酚妥拉明（0,10,30,50,70μg/ml）分別處理細胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。之后于酶標儀測450nm下吸光度值。

怎么挑選適合自己實驗的抗體

一、關于特異性的挑選：

     特異性的挑選首要需求考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、試驗方法特異性、符號物的特異性。

1、蛋白特異性：

     針對需求檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分，重組表達的蛋白和內源性蛋白的檢測，對抗體的要求是不一樣的，注意檢查抗體說明書的檢測說明。假如重組蛋白不是全長表達，則需求注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內。

內源性蛋白能清楚其剪切與潤飾的方式，特殊表型的蛋白需求進行序列比對，并結合抗體免疫原序列，檢查穿插反應的狀況。磷酸化蛋白檢測需求確認具體位點，不同位點的磷酸化意味著或許有不同的機制存在，不宜混為一談。

2、種屬特異性：

     同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或規(guī)劃多肽抗原的，根據蛋白的同源性狀況與其他種屬發(fā)生穿插反應。需求參照說明書注明的可反應種屬信息。

一些稀有種屬很難找到抗體，可以經過蛋白的序列比對，挑選同源序列免疫的抗體，不過一般這種狀況生產商不會受理其關于質量的申述，假如可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體挑選。。

3、符號物的特異性

     一般基于試驗操作的試驗方法不會運用帶有符號的一抗，比方WB、IHC等，都是經過二抗類的試劑符號達到成果出現的意圖。可是基于儀器剖析的一些試驗，或許就會運用到直接符號的一抗，比方流式試驗。那么需求了解到自己將要運用的儀器能檢測到的熒光規(guī)模，針對不通的參數要求挑選對應的符號物。在免疫熒光雙標試驗中，需求選配不同的熒光符號物。

二、抗體種屬來歷的挑選：

     有人以為單抗比多抗好，其實這并不是一個嚴謹的觀點，只能說在或許性上單抗的特異性更好一些，而多抗的親和力會優(yōu)于單抗，而且特異性并不一定就遜于單抗，首要看抗原的規(guī)劃水平。

     目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他種屬來歷抗體較少。不主張糾結于單抗好還是多抗好，能做出試驗的抗體便是好抗體。

     在挑選上一般主張試驗種屬和抗體種屬親緣性越遠越好，不宜同源?？贵w不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標試驗中，需求在差異于試驗種屬的基礎上，區(qū)分開兩個目標的抗體種屬來歷，以便于二抗差異識別。

三、關于品牌的挑選：

     由于抗體品質的異質化，關于抗體的品牌挑選就被我們所注重，可是不管是什么品牌都難免會遇到不合適自己試驗的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認可、購買方便、專業(yè)、售后處理快捷的品牌。

     一些乃至都沒有正式代理的，只能備選。一起購買時一定要找可以供給產品指導、試驗剖析、售后處理的正規(guī)代理商購買，防止由于買到假貨水貨影響試驗。

其實或許只是生產商只檢測時運用了不同的種屬不同的樣品類型，或是參照了不同的文獻，對運用者來說，相同的樣品，不管運用哪個品牌的，只需抗體是對的，意圖條帶只會出現在相同的位置。

牛(PI3K2α) ELISA 試劑盒  

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。

2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物請避光保存。

7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9. 本試劑不同批號組分不得混用。

ELISA試劑盒運用應當留心哪些事項
1、ELISA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可運用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2、濃洗刷液可能會有結晶分出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗刷時不影響效果。
3、各步加樣均應運用加樣器，并常常校正其準確性，以避免實驗過失。一次加樣時刻最好控制在5分鐘內，如標本數量多，舉薦運用排槍加樣。
4、請每次測定的一同做規(guī)范曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于規(guī)范品孔孔OD值的)，請先用樣品稀釋液稀釋必定倍數(n倍)后再測定，核算時請最終乘以總稀釋倍數(×n×5)。
5、嚴格按說明書的操作進行，ELISA試劑盒效果判定有必要以酶標儀讀數為準.
6、本試劑不同批號組分不得混用。
7、封板膜只限一次性運用，以避免穿插污染。
8、悉數樣品，洗刷液和各種廢棄物都應按感染物處理。
9、底物請避光保存。

技術提示：

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變?yōu)辄S色。

6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

8、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

試劑盒性能：

1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。

2. 批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。

抗體的保質期與儲存溫度相關嗎
作為各類種屬的高質量血清供應商，一般客戶咨詢血清購買時，我們都會推薦牛血清。而我公司zui為熱銷的血清產品中莫過于胎牛血清了，那么為何牛血清在細胞培養(yǎng)實驗中如此受寵呢？據酶聯(lián)生物技術員分析，主要原因有這五個方面：
1. 提供結合蛋白：作用是攜帶重要地低分子量物質，在細胞代謝過程中起重要作用。
2. 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。
3. 提供基本營養(yǎng)物質：氨基酸、維生等是細胞生長必須的物質。
4. 提供激素和各種生長因子。
5. 對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用。
針對第五個原因，我們來重點談談。有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現的，現在則有目的的使用血清來終止的消化作用。
我司技術員分析，這是因為已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了的粘度可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用。
特別說明到了有多位老師提出問題：人血清一定要加熱滅活嗎？不然會怎樣？其實對于它的加熱滅活是應該根據情況而定的。
很多朋友在使用實驗者認為一定需要加熱滅活，其實這個認知是不正確的，是否需要滅活是要根據情況而定。人們通常通過在56℃加熱30分鐘的辦法，來滅活其中的補體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。
加熱滅活帶來的問題是，其中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。
但是它的補體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現象。另外37℃的加熱能夠有效滅活補體。所以對它而言，并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補體。
早期的人血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現在制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以一般沒有支原體的污染。
通過以上，我們公司總結：除非有特別的情況，標準廠家生產的一般不需要加熱滅活。不過因考慮到其質量問題，為安全起見，還是以加熱滅活為好。