脲酶（UE）測(cè)試盒

本品用于科研實(shí)驗(yàn),不用于臨床。

如何處理ELISA測(cè)定抗體疫苗的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)？

在ELISA試劑盒試驗(yàn)中我們總是碰到許多關(guān)于數(shù)據(jù)處理的難題，為了能我們更多更具體的了解在試驗(yàn)中數(shù)據(jù)處理的問題，下面一起來看看ELISA測(cè)定抗體之怎么處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

ELISA做得很好的話批間CV都要有10～15％左右，用同一個(gè)抗原，但對(duì)于包被的抗原濃度對(duì)OD的影響不是很大，只要不是不同太大即可。抗血清當(dāng)然要用同一個(gè)稀釋度了。別的比較的話就必每批，每塊板上的樣品都要伴隨著一個(gè)參比品一同做，參比品仍是同一個(gè)這樣才干確保試驗(yàn)成果的可比性。

剖析：

（1）將同一只動(dòng)物免疫不同時(shí)刻后抗體產(chǎn)生的效價(jià)進(jìn)行比較。

（2）由上面能夠得出一組數(shù)據(jù)，舉個(gè)比如即如某個(gè)免疫間期抗體升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多數(shù)情況下可升高多少，即此種升高率的陽性率，然后再用泊松散布證明此陽性率是否贊同整體在這個(gè)免疫間期增高的陽性率，仍是由于隨機(jī)誤差的原因使試驗(yàn)得到了這個(gè)成果。

（3）計(jì)算出不同間期的效價(jià)水平后，能夠用方差剖析進(jìn)行整體比較，證明不同間期免疫的作用差異是否有計(jì)算學(xué)含義；然后再兩兩之間進(jìn)行比較，看免疫作用*顯著的是哪個(gè)間期。

ELISA試劑盒酶標(biāo)板在什么情況下會(huì)失效？

ELISA試劑盒的保質(zhì)期一般都是在一年，如果保存妥當(dāng)?shù)脑?，不?huì)出現(xiàn)問題的。但不要重復(fù)凍融。當(dāng)然如果是正常的DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒等，應(yīng)該放在4℃左右冰箱保存。主張ELISA試劑盒凍結(jié)后一次用完。已開封或許運(yùn)用后，剩下試劑仍需依照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，ELISA檢測(cè)試劑盒開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，防止?jié)駶?rùn)。

       但要留意的是，如果將ELISA試劑盒剛從冰箱里邊拿出來就當(dāng)即運(yùn)用的話，可能會(huì)影響，其直接的后果是對(duì)一些弱陽性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。

       主張：先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在ELISA檢測(cè)試劑盒運(yùn)用前與室溫平衡。這樣做的意圖，首要是為了在后面的溫育反響過程中，能使反響微孔內(nèi)的溫度能較快地到達(dá)所要求的高度，以滿意測(cè)定要求。

試劑盒規(guī)格中是100管和50管是什么意思?

(1)50管/48樣:50管指能夠做50次測(cè)定,48樣指可以測(cè)試48個(gè)樣品。如果每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,那么只能測(cè)定16個(gè)樣品。其中有2次測(cè)定用于

空白管或者對(duì)照管。值得特別注意的是,50管/24樣中由于每個(gè)樣品測(cè)定都需要做對(duì)照,因此能夠測(cè)定樣品的數(shù)量?jī)H為8個(gè)(假設(shè)做3次重復(fù))

(2)100管/96樣:100管指能夠做100次測(cè)定,96樣指可以測(cè)定96個(gè)樣品,如果每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,那么只能測(cè)定32個(gè)樣品。其中有4次測(cè)定用

于空白管或者對(duì)照管。注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理論測(cè)定次數(shù)少1~3次。其它規(guī)格的含義依次類推。值得特別注意的是,100

管/48樣中由于每個(gè)樣品測(cè)定都需要做對(duì)照,因此能夠測(cè)定樣品的數(shù)量?jī)H為16個(gè)(假設(shè)做3次重復(fù))。

如何防止試劑盒失效?

  不要過早訂購(gòu),以免試劑盒失效.收到試劑盒后,檢查外包裝是否正常。馬上打開,按照試劑盒說明書核對(duì)試劑數(shù)量是否正確,注意瓶中試劑狀態(tài)是否與說明書一致。如果有問題,或者懷疑,馬上聯(lián)系公司銷售,進(jìn)行確認(rèn)。如果沒有問題,請(qǐng)務(wù)必按照說明書進(jìn)行試劑的保存。注意,不同試劑,可能需要分別保存在常溫(25°℃)、4℃和-20℃,務(wù)必分別按照要求保存,不要整個(gè)試劑盒放置于冰箱。

如何進(jìn)行預(yù)測(cè)定?

(1)務(wù)必在7個(gè)工作日內(nèi)進(jìn)行預(yù)測(cè)定,以確定該試劑盒是否適合您的樣品,以免造成試劑盒和樣品的浪費(fèi)。

(2)選擇2~3個(gè)預(yù)期差異比較大的樣品,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作,注意儀器工作狀態(tài),操作規(guī)范,控制好測(cè)定條件,尤其是溫度。

(3)如實(shí)與公司銷售溝通預(yù)測(cè)定結(jié)果,公司技術(shù)人員會(huì)確認(rèn)測(cè)定結(jié)果是否正常,是否需要調(diào)整,如何進(jìn)行調(diào)整,從而確保您的測(cè)定結(jié)果可靠。

熒 光 分 析 法

      熒光分析法是指利用某些物質(zhì)被紫外光照射后處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷一個(gè)碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過程所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以進(jìn)行定性或定量分析的方法。由于有些物質(zhì)本身不發(fā)射熒光（或熒光很弱），這就需要把不發(fā)射熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成能發(fā)射熒光的物質(zhì)。例如用某些試劑（如熒光染料），使其與不發(fā)射熒光的物質(zhì)生成絡(luò)合物，各種絡(luò)合物能發(fā)射熒光，再進(jìn)行測(cè)定。因此熒光試劑的使用，對(duì)一些原來不發(fā)熒光的無機(jī)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行熒光分析打開了大門，擴(kuò)展了分析的范圍。

比色皿有哪些規(guī)格?

(1)常量比色皿,如1mL和3mL等,常量法試劑盒都是選用1mL體系,只能用1mL比色皿,不可以用更大體積的比色皿,否則試劑量不夠,無法正常比色。

(2)微量比色皿,如0.25mL和0.5mL等,微量法試劑盒都是選用0.25mL比色皿。一般客戶都選擇使用標(biāo)儀(需要自備酶標(biāo)板)

(3)紫外波長(zhǎng)檢測(cè)需要石英比色皿,不可以用普通玻璃比色皿。

(4)不同規(guī)格的比色皿,其外觀大小是一致的,都是1cm光徑(也有0.5cm光徑的比色皿,不常見,也可以用,但是計(jì)算時(shí)要注意修改計(jì)算公式),其內(nèi)

容積差異在于壁的厚度。

代測(cè)的優(yōu)點(diǎn)

(1)更加省事兒,不必為測(cè)定犯難。用戶只要提供樣品和想測(cè)定的指標(biāo),就不再需要為測(cè)定操心了,不再受到操作技能、儀器設(shè)備和時(shí)間

的限制,就等著拿到數(shù)據(jù)寫論文。

(2)測(cè)定數(shù)據(jù)更有保障。嚴(yán)格的測(cè)定質(zhì)量管理體系,從而保證了測(cè)定結(jié)果的真實(shí)可靠。我們還建立了定制度。

(3)防止樣品損失無論是用戶自己完成測(cè)定全過程,還是購(gòu)買試劑盒完成測(cè)定,都可能因?yàn)槿狈y(cè)定經(jīng)驗(yàn),導(dǎo)致測(cè)定失敗,從而損失樣品的情況。對(duì)于生命科學(xué)研究而言,樣品是最珍貴的。樣品一旦損失,輕則造成研究進(jìn)度被耽擱,重則造成研究失敗!代測(cè)能夠充分保證測(cè)定成功,從而防止了樣品損失。當(dāng)然,樣品質(zhì)量是測(cè)定成功的前提,而且樣品質(zhì)量只有用戶自己才能控制和保證。

生化檢測(cè)試劑盒的基本原理

生化檢測(cè)試劑盒,又稱生化試劑盒,是利用特定的生物成分、動(dòng)力學(xué)及化學(xué)反應(yīng)等技術(shù)制備的試劑盒,用于檢測(cè)生理學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域中特定的生物分子或化學(xué)物質(zhì)。生化檢測(cè)試劑盒包括底物、酶試劑盒、探針等多個(gè)組成部分,其中的是底物-酶法。

底物-酶法是生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的基本原理。在該過程中,底物與酶在細(xì)胞膜上結(jié)合形成基質(zhì)酶,進(jìn)而形成底物-酶復(fù)合物。隨著時(shí)間的推

移,底物-酶復(fù)合物逐漸分解,釋放出分子小的底物和分子大的未消化的底物。未消化的底物可以被一系列的酶代謝,同時(shí)底物、酶和代謝產(chǎn)物都會(huì)對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,從而影響檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。

生化試劑盒可以檢測(cè)的樣本類型有哪些?

 生化試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理是基于化學(xué)反應(yīng),理論上是不受生物種屬及樣本類型的限制。生化試劑盒樣本檢測(cè)通常只分樣本類型,不分種屬。但是某些指標(biāo)在不同種屬或類型樣本中的提取方式不同。因此,具體情況請(qǐng)參見說明書或與技術(shù)支持聯(lián)系確認(rèn)。

生化試劑盒樣本檢測(cè)的一般要求:

1)于生化檢測(cè)而言,樣本最-好無溶血、脂血、黃-疸的現(xiàn)象。組織樣本需將血液洗凈擦干后再進(jìn)行稱重處理。

2)樣本處理后最-好盡快進(jìn)行檢測(cè),且保存于冰盒之上,待測(cè)。

3)樣本需澄清,若不澄清,需離心后取上清進(jìn)行檢測(cè)(特殊指標(biāo)除外)。

4)樣本值應(yīng)在試劑盒線性范圍內(nèi),若超過線性范圍,需稀釋后再進(jìn)行檢測(cè),若低于檢測(cè)范圍,需增加樣本濃度后進(jìn)行檢測(cè)。

微 量 分 析 法  

     微量分析(Microanalysis)在化學(xué)分析中，其試樣重量為1-10mg的化學(xué)分析方法稱為微量分析。有微量定性分析和微量定量分析之分，定性常采用點(diǎn)滴反應(yīng)和顯微結(jié)晶反應(yīng)等靈敏度較高的分析方法，定量分析常用重量、容量及儀器等分析方法。在以試樣重量不同的分析分類中還有半微量分析和超微量分析等。

培養(yǎng)基的防霉以及霉后的處理方法

防霉辦法

1、培育果蠅的器皿要嚴(yán)格消毒。培育瓶洗潔凈后，自然涼干，再與棉塞一道進(jìn)行高溫枯燥滅菌(120℃，30min) 。

2、養(yǎng)分要全面。種類許多，本實(shí)驗(yàn)室用的是玉米培育基。

配方：

水750mL煮開，加瓊脂6.2g，待瓊脂溶解后加白糖62.5g，拌和溶解后加調(diào)成糊狀的玉米糊，煮開2～3min，加酵母粉7g，加熱1～2min，拌和均勻后，移去火源，加丙酸2mL。培育基稍稍冷卻后，倒入已滅菌的瓶中，盡量不要粘在瓶壁上，塞好棉塞，放入仍有余熱的枯燥箱中將瓶壁上的水蒸干。

3、接種時(shí)消好毒。在無菌室內(nèi)接種，如沒有無菌室，在接種前用75%酒精棉球擦雙手一遍。接種后，放入適宜果蠅成長(zhǎng)溫度的培育箱中培育果蠅(溫度20～25℃)，一旦下一代成蠅孵出來后，這樣就就不易長(zhǎng)霉啦。

培育基的霉后處理辦法

由于霉菌孢子漂浮于培育瓶的整個(gè)空間，包括果蠅身上，如將此果蠅接種到新的里邊，大約經(jīng)過4 ～5d，培育基將會(huì)重新長(zhǎng)出霉菌來。遇到該問題，解決的辦法只要兩種：① 不再接種這種長(zhǎng)霉菌果蠅，重新接種未長(zhǎng)霉的果蠅；② 采取辦法殺死果蠅身上的霉菌孢子。

殺霉菌辦法：

將帶有霉菌孢子的成蠅倒入空培育瓶中，棉塞上倒適量的75%酒精，再將瓶口塞緊，使用酒精具有蒸發(fā)性，蒸發(fā)后的酒精充滿整個(gè)瓶?jī)?nèi)，從而將果蠅身上的霉孢子殺死。

上海酶聯(lián)生物提醒注意：

1、倒在棉塞上的酒精量要適宜，過多果蠅易醉昏，過少殺死不了霉菌孢子；

2、果蠅呆在空瓶?jī)?nèi)的時(shí)間要恰當(dāng)，以2d為好。

脲酶（UE）測(cè)試盒

本品用于科研實(shí)驗(yàn),不用于臨床。

測(cè)定意義:

輔酶NAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時(shí),形成大量的 ROS,同時(shí) NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測(cè)定原理:

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH,NADH 通過 PMS 的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在 570nm 下檢測(cè)吸光值;而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為 NADH,進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測(cè)。

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

酸性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

堿性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑四:粉劑×1 瓶,4 ℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑五:液體 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑六:液體 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑七:液體 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取:

1 血清(漿)中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL 血清(漿),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

NADH 的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL血清(漿),加入 1mL 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2 組織中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):酸性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心

10min,取上清,置冰上待測(cè)。NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):堿性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

混勻,取 200μL 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下讀取對(duì)照吸光值 A1 和測(cè)定管吸光值 A2,計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng):

1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別:對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若 NAD+測(cè)定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 測(cè)定中△A(A2-A1)≤0.0222,說明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測(cè)限,可做如下調(diào)整:(1)將測(cè)定管避光靜置時(shí)間 20min 延長(zhǎng)到 60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取 0.2g 樣本或 0.2mL 樣本加入 1mL 提取液。

5、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管,本試劑盒 100 管保證測(cè) 48 個(gè) NAD+或 NADH.

NAD+和 NADH 含量的計(jì)算:

(一) NAD+含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中 y 為△A,x 為 NAD+濃度 nmol/mL

1、血清(漿)中 NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+(nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+(nmol/g 鮮重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+(nmol/104 cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)

(二)NADH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中 y 為△A,x 為 NADH 濃度 nmol/mL

1、血清(漿)中 NADH 含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

注 意: 檢測(cè)限為 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot