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豚鼠葡萄調(diào)節(jié)蛋白(GKRP) ELISA 試劑盒

  • 產(chǎn)品型號:96T/48T
  • 更新時間:2024-09-12

簡要描述:豚鼠葡萄調(diào)節(jié)蛋白(GKRP) ELISA 試劑盒 :質(zhì)量穩(wěn)定,準(zhǔn)確性高。篤瑪生物全程提供技術(shù)指導(dǎo),確保您實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性還提供免費(fèi)代測服務(wù)。您只需提供代測樣本,七個工作日內(nèi)即可為您提供代測數(shù)據(jù)。歡迎前來咨詢,訂購。

產(chǎn)品詳情

豚鼠葡萄調(diào)節(jié)蛋白(GKRP) ELISA 試劑盒


獲得idea的兩種途徑:


1. 自上而下:先閱讀大量科研論文,弄清目前的研究現(xiàn)狀和要解決的問題等;


2. 自下而上:自己先冥思苦想一段時間,有了自己的idea后再去查文獻(xiàn)。


但值得注意的是,別人沒做過的東西,也許不是因為別人沒想到,很可能是因為沒有意義或者沒有可能性。



獲得好idea的基礎(chǔ)前提包括:


首先在科研前必須彌補(bǔ)基礎(chǔ)知識,這是看懂文獻(xiàn)的基礎(chǔ);其次廣泛閱讀文獻(xiàn);然后學(xué)會閱讀文獻(xiàn),讀懂文章。


拿到一篇研究性論文,先看標(biāo)題,立即停住,問自己幾個問題:


(1)這文章是怎么做的(可參考材料方法)?會做哪些內(nèi)容來說明其標(biāo)題?


(2)為什么要做這個?


(3)如文章是近半年內(nèi)發(fā)表的,該文章解決了什么問題?引出了什么問題(結(jié)合你看的綜述)?接下來仔細(xì)看摘要,看你的想法是否與別人吻合?


(4)看完實驗結(jié)果,再思考有什么地方不完善?有沒有深入或拓展到底?下面還有什么問題可做,關(guān)鍵是你自己要思考,去發(fā)現(xiàn)。長期作戰(zhàn),持之以恒。



為何牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中如此受寵

作為各類種屬的高質(zhì)量血清供應(yīng)商,一般客戶咨詢血清購買時,我們都會推薦牛血清。而我公司zui為熱銷的血清產(chǎn)品中莫過于胎牛血清了,那么為何牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中如此受寵呢?據(jù)酶聯(lián)生物技術(shù)員分析,主要原因有這五個方面:

1. 提供結(jié)合蛋白:作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì),在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。

2. 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。

3. 提供基本營養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生等是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。

4. 提供激素和各種生長因子。

5. 對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。

針對第五個原因,我們來重點談?wù)?。有一些?xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的,現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止的消化作用。

我司技術(shù)員分析,這是因為已經(jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了的粘度可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷,特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時,粘度起到重要作用。還含有一些微量元素和離子,他們在代謝解毒中起重要作用。

特別說明到了有多位老師提出問題:人血清一定要加熱滅活嗎?不然會怎樣?其實對于它的加熱滅活是應(yīng)該根據(jù)情況而定的。

很多朋友在使用實驗者認(rèn)為一定需要加熱滅活,其實這個認(rèn)知是不正確的,是否需要滅活是要根據(jù)情況而定。人們通常通過在56℃加熱30分鐘的辦法,來滅活其中的補(bǔ)體,以及其中可能的微生物(比如支原體)的污染。

加熱滅活帶來的問題是,其中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。

但是它的補(bǔ)體含量很低,即使在未稀釋的胎牛血清中,也觀察不到溶血現(xiàn)象。另外37℃的加熱能夠有效滅活補(bǔ)體。所以對它而言,并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補(bǔ)體。

早期的人血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um,不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現(xiàn)在制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um,所以一般沒有支原體的污染。

通過以上,我們公司總結(jié):除非有特別的情況,標(biāo)準(zhǔn)廠家生產(chǎn)的一般不需要加熱滅活。不過因考慮到其質(zhì)量問題,為安全起見,還是以加熱滅活為好。



ELISA試劑盒的那點兒事

酶聯(lián)免疫吸附測定,又稱酶聯(lián)免疫吸附試驗,即ELISA,是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用的技術(shù)。1971年Engvall等人發(fā)表了使用ELISA定量測定IgG的文章,將1966年用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。

ELISA的原理

ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上,利用抗原抗體特異性結(jié)合,檢測過程中,通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物,最終酶促反應(yīng)后的底物的顏色,對樣本中蛋白進(jìn)行定性與定量。

不按說明書操作會造成的后果

每一個試劑盒里都會有對應(yīng)的說明書,注意事項里大多都會提到“實驗嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行"。為什么要嚴(yán)格按照說明書操作?為了更完整的回答這個問題,需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀及檢測的具體條件,可設(shè)計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類:

1.雙抗體夾心法測抗原

2.雙抗原夾心法測抗體

3.競爭法測抗原

4.間接法測抗體


總結(jié)如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。

A. 先說最嚴(yán)重的操作錯誤,看錯或壓根不看試劑盒配套說明書,不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當(dāng)作雙抗體夾心法來做,導(dǎo)致的結(jié)果就是整板顯示很強(qiáng)的藍(lán)色,無任何梯度。


B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒,所含的試劑成分很可能是不一樣的,混用導(dǎo)致的結(jié)果是,浪費(fèi)珍貴的樣本,樣品的回收率達(dá)不到預(yù)期值,如果混用不同試劑盒的酶復(fù)合物,會導(dǎo)致顯色過弱或過強(qiáng),因為每種試劑盒所用酶復(fù)合物效價可能不一樣。

C. 不看文獻(xiàn)或者不做預(yù)實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻(xiàn)報道推算樣本應(yīng)該1:10稀釋,結(jié)果稀釋成1:1000,導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過弱,結(jié)果不可用。

D. 不校準(zhǔn)移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導(dǎo)致工作試劑濃度不準(zhǔn)確,孵育溫度不合適,實驗帶來誤差。

E. 洗滌不充分,每孔洗液加樣過少,或者殘留。導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過快,同時背景較高。

F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液,導(dǎo)致洗液污染,整個實驗失敗。

G. 剩余酶標(biāo)板條未及時放入干燥袋,導(dǎo)致酶標(biāo)板受潮,下一次再做時,顯色過弱或污染,CV值過高。


  ELISA常見主要試劑

1. 抗體:單抗特異性強(qiáng),多抗結(jié)合性高,試劑盒需要高效的配對。

2. 2.抗原:大多為重組蛋白,細(xì)胞因子和待測樣本,高效標(biāo)準(zhǔn)品需NIBSC/WHO校準(zhǔn)。

3. 3.顯色作用體系:首先辣根過氧化物酶(HRP)與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系,再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物,還有葡萄糖氧化酶(GOD)的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色,最后β-D-半乳糖苷(β-D-Gal)的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷(4MUG)可生成高強(qiáng)度熒光。

ELISA的類型

根據(jù)試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件,可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法,按照原理及操作,市面的方法有:

  1.間接法ELISA

是檢測抗體的方法,原理為利用酶標(biāo)記的二抗以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體,顯色測定。優(yōu)勢在于待測一抗無需標(biāo)記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似,區(qū)別在于一抗酶標(biāo),檢測孵育也以抗原為主,但直接法ELISA的靈敏度有限,需權(quán)衡使用。

2.夾心法ELISA

又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA,原理相似,用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例,捕獲抗體包被在固相載體上,加入抗原或待測樣本結(jié)合,后加入的檢測抗體結(jié)合在抗原上,形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。

3.競爭法ELISA

小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA,待檢樣本中抗原越多,被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量會減少,彼此形成競爭負(fù)相關(guān)體系,顯色物質(zhì)也就越少,根據(jù)顯色物質(zhì)的比例可擬合得到待測抗原含量。

4.其他方法

a.免疫抑制法測ELISA:固相包被抗原,被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比,二者之差為待測抗原含量,原理類似與競爭法ELISA。

b.阻斷ELISA:目的檢測特異性抗體,也稱為競爭ELISA,原理為固相包被抗原,待測樣本與一抗酶標(biāo)競爭孵育,待檢樣本中抗體越多,顯色越淺,反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。

c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA,有固相載體改變的Dot-ELISA(硝酸纖維素膜)和C-ELISA(滌綸布),還有技術(shù)分類的TRFIA和多因子檢測等。

ELISA的評估

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣,優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標(biāo)進(jìn)行測定評估,分析如下:

  1、準(zhǔn)確性

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣,優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標(biāo)進(jìn)行測定評估,分析如下:

a.回收率:測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實性的校準(zhǔn),過高或偏低會產(chǎn)生加樣和假性性的失準(zhǔn)數(shù)據(jù)。

b.線性:測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準(zhǔn)確性,過高或偏低均會出現(xiàn)測定的偏差。

  2、精確度

a.板內(nèi)精確度:評價單次實驗中,同一個已知濃度不同復(fù)孔的差異。

b.板間精確度:評價同一樣本,多次實驗的差異。

 3、精密度

檢測限:能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應(yīng)的濃度,用于評估試劑盒的靈敏度,值越低試劑盒靈敏度越高。

  4、特異性

a.交叉反應(yīng):評判特異性,不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力,交叉反應(yīng)越大,特異性越差。

b.抗干擾能力:同源物的干擾,內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。

  5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定,避免假陽性或假陰性結(jié)果。

  6、穩(wěn)定性

試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標(biāo)檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高,試劑盒存儲時間越久。

ELISA的應(yīng)用

ELISA技術(shù)是特定靶標(biāo)蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn),提供快速,穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果??梢詫ι锎蠓肿?小分子的定量,對親和力測定評價或者篩選,還可對重組蛋白或細(xì)胞因子進(jìn)行活性比對分析等運(yùn)用。常應(yīng)用于細(xì)胞因子,趨化因子,生長因子等檢測,同時應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的靶標(biāo)。

ELISA實驗所用試劑-酶的底物與最后步驟詳解介紹!

1,酶的底物

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HRP的底物

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HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng),代表性的過氧化物為H2O2,其反應(yīng)式如下:DH2+ H2O2 D+ H2O

  上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色,用酸終止酶反應(yīng)后,在492nm處有最高吸收峰,靈敏度高,比色方便,是HRP結(jié)合物的底物。OPD本身難溶于水,OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性,操作時應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì),與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中,OPDH2O2一般分成二組分,OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,片劑中含有發(fā)泡助溶劑,使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中,有制成易保存的濃縮液,使用時用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

  TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色,目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,可配成溶液試劑,只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有無致癌性等優(yōu)點,因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCLH2SO4終止后,TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色,可在比色計中定量,最適吸收波長為405nm

ABTS雖不如OPDTMB敏感,但空白值極低,也為一些試劑盒所采用。

  另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],經(jīng)HRP作用后,產(chǎn)物顯熒光,可用熒光光度計測量。用于ELISA的優(yōu)點為可加寬定量測定的線性范圍。

  HRP對氫受體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多,但尿素過氧化物為固體,作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑,用蒸餾水溶解后,在底物緩沖液中密閉、低溫(28℃)可穩(wěn)定1年。





豚鼠葡萄調(diào)節(jié)蛋白(GKRP) ELISA 試劑盒

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AP的底物

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  AP為磷酸酯酶,一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,可制成片劑,使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚,在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮),可用于ELISA作熒光測定,敏感度較高于用顯色底物的比色法。

2,洗滌液

  在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

3, 酶反應(yīng)終止液

  常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的最終體積而異,在板式ELISA中一般采用2mol/L

4,陽性對照品和陰性對照品

  陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品,同時也作為判斷結(jié)果的對照,因此對照品,特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定,對照品最好也為人血清,因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到,國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料,即在血漿中加入鈣離子,使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,除去凝塊后所得的液體,其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測,確定其中不含待測物質(zhì)。

例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),其中加入一定量的待檢物質(zhì),此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱,在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較,可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAgELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml,陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑,以利保存。

5,參考標(biāo)準(zhǔn)品

  定量測定的ELISA試劑盒(例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等)應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品,應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度,一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。








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