豚鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α) ELISA 試劑盒

抗體種屬來歷的挑選：

有人以為單抗比多抗好，其實這并不是一個嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠^點，只能說在或許性上單抗的特異性更好一些，而多抗的親和力會優(yōu)于單抗，而且特異性并不一定就遜于單抗，首要看抗原的規(guī)劃水平。

目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他種屬來歷抗體較少。不主張糾結(jié)于單抗好還是多抗好，能做出試驗的抗體便是好抗體。

在挑選上一般主張試驗種屬和抗體種屬親緣性越遠(yuǎn)越好，不宜同源。抗體不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標(biāo)試驗中，需求在差異于試驗種屬的基礎(chǔ)上，區(qū)分開兩個目標(biāo)的抗體種屬來歷，以便于二抗差異識別。

三、關(guān)于品牌的挑選：

由于抗體品質(zhì)的異質(zhì)化，關(guān)于抗體的品牌挑選就被我們所注重，可是不管是什么品牌都難免會遇到不合適自己試驗的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認(rèn)可、購買方便、專業(yè)、售后處理快捷的品牌。

一些乃至都沒有正式代理的，只能備選。一起購買時一定要找可以供給產(chǎn)品指導(dǎo)、試驗剖析、售后處理的正規(guī)代理商購買，防止由于買到假貨水貨影響試驗。

其實或許只是生產(chǎn)商只檢測時運用了不同的種屬不同的樣品類型，或是參照了不同的文獻(xiàn)，對運用者來說，相同的樣品，不管運用哪個品牌的，只需抗體是對的，意圖條帶只會出現(xiàn)在相同的位置。

抗體的保質(zhì)期與儲存溫度相關(guān)嗎

作為各類種屬的高質(zhì)量血清供應(yīng)商，一般客戶咨詢血清購買時，我們都會推薦牛血清。而我公司zui為熱銷的血清產(chǎn)品中莫過于胎牛血清了，那么為何牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中如此受寵呢？據(jù)酶聯(lián)生物技術(shù)員分析，主要原因有這五個方面：

1. 提供結(jié)合蛋白：作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。

2. 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機械損傷。

3. 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生等是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。

4. 提供激素和各種生長因子。

5. 對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護作用。

針對第五個原因，我們來重點談?wù)劇Ｓ幸恍┘?xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止的消化作用。

ELISA試劑盒采樣的準(zhǔn)備保證和運輸要求

采樣ELISA試劑盒準(zhǔn)備包裝和運輸要求：

1）準(zhǔn)備無菌容器、樣品標(biāo)簽、采樣登記表、記號筆、樣品運輸過程中所需物品(如包裝箱、冷藏設(shè)備)等。

2）采集樣品的在樣品采集、運輸、儲存等過程中，應(yīng)采取必要的措施防止交叉污染和環(huán)境污染及食品中微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。

3）樣品應(yīng)在接近原有儲存溫度的條件下傳送，冷凍、冷藏的樣品應(yīng)能達(dá)到規(guī)定溫度，樣品送到實驗室應(yīng)越快越好，如果路途遙遠(yuǎn)，應(yīng)將不需冷凍的樣品都保存在2℃-5℃環(huán)境中；

4）冷凍產(chǎn)品可以冷凍運輸或者在允許解凍的情況下冷藏運輸，但樣品溫度不得超過 8℃，一旦解凍不得再次冷凍，保持冷卻即可。

ELISA試劑盒為了更好的服務(wù)好每一位顧客，始終把產(chǎn)品品質(zhì)和人力資源視為企業(yè)發(fā)展的原動力，“崇尚品質(zhì)，以人為本"，堅決抵制低劣、偽冒產(chǎn)品的不正當(dāng)競爭。

在注重產(chǎn)品品質(zhì)和人才隊伍的同時也建立了一套、物流、售后服務(wù)等服務(wù)體系，為您提供快速穩(wěn)定的供應(yīng)、無可挑剔的質(zhì)量、貼心的服務(wù)。

挑選一個基因檢測的試劑盒應(yīng)該考慮哪些方面

顯然，我們要從效率，經(jīng)濟，是否好用以及是否可以達(dá)到你的實驗?zāi)康倪@四個層面綜合評判了。

例如：我們通常在同樣可以達(dá)到實驗?zāi)康牡那疤嵯?，在比較趕時間的時候或者說時間不充裕了，我們傾向于選擇進口的，而非國產(chǎn)的。

為什么？因為試劑盒有時候也會有不合格的，所以進口的雖然價格相對貴一些，但考慮到容錯率的問題以及時間的緊迫性，我們會選擇進口的更保險（當(dāng)然這里不是說國產(chǎn)的不好，因為畢竟每一批的貨不管是進口還是國產(chǎn)他都會存在一定百分比的不合格或者質(zhì)量不過關(guān)的情況）。

上海酶聯(lián)生物科技有限公司經(jīng)過數(shù)年的努力發(fā)展已迅速成為集產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、經(jīng)營為一體的專業(yè)化生物工程公司。

當(dāng)然換言之，時間充裕的時候可以選擇國產(chǎn)的試劑盒去檢測，經(jīng)濟實惠，效果可能比進口相當(dāng)?shù)?。另外，檢測基因如因子這塊，你的樣本較多的話可以選擇ELISA，如48或者96孔板的。當(dāng)然檢測基因在業(yè)界更的方法是用qPCR的方法去檢測的。當(dāng)然價格顯然是要貴很多。

抗體操作中還應(yīng)注意如下問題：

1、熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。

2、熱處理時要防止切片干燥。

3、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法。

4、同一批抗原的檢測所用溫度和時間確保一致。

5、注意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變（一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿會明顯被破壞，對細(xì)胞核的影響較大，會出現(xiàn)核破裂與蘇木到淡染等現(xiàn)象；而經(jīng)酶水解的切片，其細(xì)胞漿破壞視消化時間長短而異，但核破壞較輕）。

6、如果在常用的緩沖液中無法實現(xiàn)抗原修復(fù)，或經(jīng)修復(fù)后的抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液，或加一些螯合劑，如EDTA等可改善某些抗原的修復(fù)。

用于免疫酶組織化學(xué)抗原修復(fù)的消化酶很多，所選酶的種類、使用的濃度、pH、消化時間及溫度等均要視組織固定的不同，所檢測抗原的性質(zhì)與組織類型的不同而異，應(yīng)通過預(yù)實驗摸索確定。

  ELISA常見主要試劑

1. 抗體：單抗特異性強，多抗結(jié)合性高，試劑盒需要高效的配對。

2. 2.抗原：大多為重組蛋白,細(xì)胞因子和待測樣本，高效標(biāo)準(zhǔn)品需NIBSC/WHO校準(zhǔn)。

3. 3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強度熒光。

ELISA的類型

根據(jù)試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法，按照原理及操作，市面的方法有：

  1.間接法ELISA

是檢測抗體的方法，原理為利用酶標(biāo)記的二抗以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，顯色測定。優(yōu)勢在于待測一抗無需標(biāo)記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區(qū)別在于一抗酶標(biāo)，檢測孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權(quán)衡使用。

2.夾心法ELISA

又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測樣本結(jié)合，后加入的檢測抗體結(jié)合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。

3.競爭法ELISA

小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量會減少，彼此形成競爭負(fù)相關(guān)體系，顯色物質(zhì)也就越少，根據(jù)顯色物質(zhì)的比例可擬合得到待測抗原含量。

4.其他方法

a.免疫抑制法測ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測抗原含量，原理類似與競爭法ELISA。

b.阻斷ELISA：目的檢測特異性抗體，也稱為競爭ELISA，原理為固相包被抗原，待測樣本與一抗酶標(biāo)競爭孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。

c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（硝酸纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術(shù)分類的TRFIA和多因子檢測等。

ELISA的評估

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標(biāo)進行測定評估，分析如下：

  1、準(zhǔn)確性

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標(biāo)進行測定評估，分析如下：

a.回收率：測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實性的校準(zhǔn)，過高或偏低會產(chǎn)生加樣和假性性的失準(zhǔn)數(shù)據(jù)。

b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準(zhǔn)確性，過高或偏低均會出現(xiàn)測定的偏差。

  2、精確度

a.板內(nèi)精確度：評價單次實驗中，同一個已知濃度不同復(fù)孔的差異。

b.板間精確度：評價同一樣本，多次實驗的差異。

 3、精密度

檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應(yīng)的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

  4、特異性

a.交叉反應(yīng)：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應(yīng)越大，特異性越差。

b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。

  5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。

  6、穩(wěn)定性

試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標(biāo)檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時間越久。

ELISA的應(yīng)用

ELISA技術(shù)是特定靶標(biāo)蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果?？梢詫ι锎蠓肿?小分子的定量，對親和力測定評價或者篩選，還可對重組蛋白或細(xì)胞因子進行活性比對分析等運用。常應(yīng)用于細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的靶標(biāo)。

ELISA實驗所用試劑-酶的底物與最后步驟詳解介紹！

1，酶的底物

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HRP的底物

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HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O

　　上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

　OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

　　TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

　　另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優(yōu)點為可加寬定量測定的線性范圍。

　　HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

豚鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α) ELISA 試劑盒

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AP的底物

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　　AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

2，洗滌液

　　在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

3，　酶反應(yīng)終止液

　　常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

4，陽性對照品和陰性對照品

　　陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。

例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

5，參考標(biāo)準(zhǔn)品

　　定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。