綿羊中性粒細胞(NE/ELA2) ELISA 試劑盒

試劑盒局限
6號標(biāo)準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準曲線無法得到精確的結(jié)果。
試劑盒性能
1、靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標(biāo)準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2、特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。
3、重復(fù)性高：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

如何保證ELISA試劑盒的質(zhì)量
辦法學(xué)的影響
ELISA測定模式包含以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競賽抑制法，其中競賽抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作時差所引起的平競賽等要素的影響，成果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。
第二、試劑要素
不同批次的ELISA試劑在制造進程中很難確保質(zhì)量一致，即使是經(jīng)過批批檢的項目其檢測成果也存在差異，因而必須選擇和訂貨長批號的試劑，并確保保存條件。嚴厲執(zhí)行這一規(guī)范可以防止因試劑批號改動而從頭樹立質(zhì)控系統(tǒng)及從頭評估試劑的雜亂進程，并且可以確保成果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，防止重復(fù)凍融造成試劑的失效。
第三、樣本要素
標(biāo)本攪擾要素包含內(nèi)源性攪擾要素和外源性攪擾要素，ELISA試劑盒前者包含類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、等，后者包含標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細菌污染、標(biāo)本儲存時間過長、標(biāo)本凝結(jié)不全、冷凍標(biāo)本的重復(fù)凍融等。
第四、操作要素
ELISA操作步驟雜亂，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。加樣、溫育、洗滌、顯色、比色。
 第五、灰區(qū)的設(shè)置
通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性"和“陰性"來陳述成果，兩者間有一條分界線被稱為
“陽性判斷值"(cut-off value，CO值)，這是定性免疫測定成果陳述的依據(jù)。

第六、標(biāo)本復(fù)查
ELISA手工檢測進程雜亂，影響要素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成成果的差異，因而加大復(fù)查力度是確保成果準確性的牢靠辦法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標(biāo)本及罕見模式的檢測成果進行復(fù)查。
第七、常表明成果的常用辦法
1.定性測定
2.半定量測定 成果一般以滴度表明。
3.定量測定 即用已知量的規(guī)范品作一系列稀釋后進行ELISA測定，制作規(guī)范曲線，成果以jue對量或單位表明。在ELISA試劑盒定量檢測中每一塊反應(yīng)板都必須制作相應(yīng)的規(guī)范曲線。
不按說明書操作會造成的后果
     
每一個試劑盒里都會有對應(yīng)的說明書，注意事項里大多都會提到“實驗嚴格按照說明書的操作進行"。為什么要嚴格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。
根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀及檢測的具體條件，可設(shè)計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：
1.雙抗體夾心法測抗原
2.雙抗原夾心法測抗體
3.競爭法測抗原
4.間接法測抗體
 
總結(jié)如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。
A. 先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當(dāng)作雙抗體夾心法來做，導(dǎo)致的結(jié)果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。
B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導(dǎo)致的結(jié)果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預(yù)期值，如果混用不同試劑盒的酶復(fù)合物，會導(dǎo)致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復(fù)合物效價可能不一樣。
C. 不看文獻或者不做預(yù)實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應(yīng)該1:10稀釋，結(jié)果稀釋成1:1000，導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過弱，結(jié)果不可用。
D. 不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導(dǎo)致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。
E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過快，同時背景較高。
 F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導(dǎo)致洗液污染，整個實驗失敗。
G. 剩余酶標(biāo)板條未及時放入干燥袋，導(dǎo)致酶標(biāo)板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。




怎么挑選適合自己實驗的抗體
一、關(guān)于特異性的挑選：
特異性的挑選首要需求考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、試驗方法特異性、符號物的特異性。
1、蛋白特異性：
針對需求檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分，重組表達的蛋白和內(nèi)源性蛋白的檢測，對抗體的要求是不一樣的，注意檢查抗體說明書的檢測說明。假如重組蛋白不是全長表達，則需求注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。
內(nèi)源性蛋白能清楚其剪切與潤飾的方式，特殊表型的蛋白需求進行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列，檢查穿插反應(yīng)的狀況。磷酸化蛋白檢測需求確認具體位點，不同位點的磷酸化意味著或許有不同的機制存在，不宜混為一談。
2、種屬特異性：
同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或規(guī)劃多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性狀況與其他種屬發(fā)生穿插反應(yīng)。需求參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息。
一些稀有種屬很難找到抗體，可以經(jīng)過蛋白的序列比對，挑選同源序列免疫的抗體，不過一般這種狀況生產(chǎn)商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申述，假如可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體挑選。。
3、符號物的特異性
一般基于試驗操作的試驗方法不會運用帶有符號的一抗，比方WB、IHC等，都是經(jīng)過二抗類的試劑符號達到成果出現(xiàn)的意圖?？墒腔趦x器剖析的一些試驗，或許就會運用到直接符號的一抗，比方流式試驗。那么需求了解到自己將要運用的儀器能檢測到的熒光規(guī)模，針對不通的參數(shù)要求挑選對應(yīng)的符號物。在免疫熒光雙標(biāo)試驗中，需求選配不同的熒光符號物。

二、抗體種屬來歷的挑選：
     有人以為單抗比多抗好，其實這并不是一個嚴謹?shù)挠^點，只能說在或許性上單抗的特異性更好一些，而多抗的親和力會優(yōu)于單抗，而且特異性并不一定就遜于單抗，首要看抗原的規(guī)劃水平。
目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他種屬來歷抗體較少。不主張糾結(jié)于單抗好還是多抗好，能做出試驗的抗體便是好抗體。
在挑選上一般主張試驗種屬和抗體種屬親緣性越遠越好，不宜同源?？贵w不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標(biāo)試驗中，需求在差異于試驗種屬的基礎(chǔ)上，區(qū)分開兩個目標(biāo)的抗體種屬來歷，以便于二抗差異識別。

三、關(guān)于品牌的挑選：
     由于抗體品質(zhì)的異質(zhì)化，關(guān)于抗體的品牌挑選就被我們所注重，可是不管是什么品牌都難免會遇到不合適自己試驗的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認可、購買方便、專業(yè)、售后處理快捷的品牌。
一些乃至都沒有正式代理的，只能備選。一起購買時一定要找可以供給產(chǎn)品指導(dǎo)、試驗剖析、售后處理的正規(guī)代理商購買，防止由于買到假貨水貨影響試驗。
其實或許只是生產(chǎn)商只檢測時運用了不同的種屬不同的樣品類型，或是參照了不同的文獻，對運用者來說，相同的樣品，不管運用哪個品牌的，只需抗體是對的，意圖條帶只會出現(xiàn)在相同的位置。

ELISA試劑盒技術(shù)流程 

技術(shù)提示：
1、混合蛋白溶液時，避免起泡。
2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。
3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件。
4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。
5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。
6、實驗中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標(biāo)明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。
8、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進行處置。
 
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。

操作注意事項
1）試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準品應(yīng)丟棄，不可保存。
2）實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3）不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4）使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5）使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6）洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7）底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8）加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9）按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
試劑盒試劑的準備
1）標(biāo)準品：標(biāo)準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準品振蕩混勻。
2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
試劑盒操作步驟
1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2）根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3）加入稀釋好后的標(biāo)準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8）取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9）在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的待測物質(zhì)標(biāo)準品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的待測物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

綿羊中性粒細胞(NE/ELA2) ELISA 試劑盒    

本試劑供研究使用       

實驗?zāi)康模?/span>

本試劑盒可用于測定血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液等
自備材料

1）蒸餾水。
2）加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振蕩器及磁力攪拌器等。

試劑盒安全性

1）避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2）實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

 

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
 

操作步驟

1. 標(biāo)準品的加樣：設(shè)置標(biāo)準品孔和樣本孔，標(biāo)準品孔各加不同濃度的標(biāo)準品50μL。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。
8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
 
 計算：
以標(biāo)準物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準物的濃度與OD值計算出標(biāo)準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。
2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準.
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。