人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78) ELISA 試劑盒

試劑盒組成：

試劑盒性能：

檢測范圍：5 pg/mL – 160 pg/mL。

靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15%

實驗原理:

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種常用的免疫學(xué)檢測方法，其基本原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)記的抗體或抗原與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，產(chǎn)生反應(yīng)后，加入底物溶液，利用酶促反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化，進行定量或定性分析。ELISA試劑盒就是根據(jù)這個原理制成的，可以用于檢測各種生物分子及其相互作用。

樣本實驗準備:

在收集樣本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天就進行檢測的樣本，及時儲存在4℃?zhèn)溆?。對于隔天再檢測的樣本，及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，有條件的，最好-70℃凍存?zhèn)溆谩?biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

液體類標(biāo)本:  包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。

1. 血清：

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

2. 血漿：

應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

3. 尿液：

用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：

檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。

5. 培養(yǎng)細胞

檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

6. 組織標(biāo)本

切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78) ELISA 試劑盒

實驗步驟:
1. 準備工作
（1）實驗前確保試劑盒、標(biāo)準品、待測樣本、酶標(biāo)板、抗體、底物等處于有效期內(nèi)，并按照說明書要求配置所需試劑。
（2）準備干凈的酶標(biāo)板，編號后分別加入100μL標(biāo)準品和待測樣本，同時設(shè)置空白孔作為對照。
2. 溫育
將酶標(biāo)板密封，置于37℃恒溫箱中溫育1小時。
3. 洗滌
溫育結(jié)束后，用洗滌液充分洗滌酶標(biāo)板，每次洗滌3遍，以去除未結(jié)合的抗原或抗體。
4. 加入酶標(biāo)抗體
洗滌后，加入100μL酶標(biāo)抗體至每個孔中，輕輕搖動酶標(biāo)板，使抗體充分結(jié)合。
5. 溫育
將酶標(biāo)板再次密封，置于37℃恒溫箱中溫育30分鐘。
6. 洗滌
洗滌酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。
7. 加入底物溶液
加入100μL底物溶液至每個孔中，室溫下避光反應(yīng)15-30分鐘。
8. 終止反應(yīng)
加入100μL終止液至每個孔中，迅速混勻，終止反應(yīng)。
9. 測定吸光度值
用酶標(biāo)儀在波長450nm處測定各孔的吸光度值。

結(jié)果分析:
根據(jù)標(biāo)準品濃度與吸光度值繪制標(biāo)準曲線，通過線性回歸方程計算待測樣本中PCSK9的濃度。同時，可通過計算樣本的OD值與標(biāo)準曲線的相關(guān)性，判斷樣本的PCSK9濃度是否在正常范圍內(nèi)。

注意事項:
1. 實驗過程中要保持酶標(biāo)板的清潔干燥，避免污染。
2. 每次洗滌酶標(biāo)板時，要確保洗滌液充分接觸每個孔壁，以去除未結(jié)合的抗原或抗體。
3. 在加入底物溶液和終止液時，要確保溶液覆蓋整個孔面，避免出現(xiàn)氣泡。
4. 實驗過程中要保持室內(nèi)溫度和濕度的恒定，以確保實驗結(jié)果的準確性。

合作單位:

中國醫(yī)科大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、北京大學(xué)、貴陽醫(yī)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

天津疾控中心、江南大學(xué)、山東大學(xué)、青島大學(xué)、香港大學(xué)

云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院

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